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大型奶牛场是如何进行胚胎移植的?

作者:admin | 发布时间:2022-07-25 16:42 | 标签:胚胎移植奶牛场

虽然偶尔会在牛身上采集单个母牛胚胎,但大多数牛胚胎移植是在激素处理后完成的,以使供体奶牛超排卵并在采集过程中最大限度地恢复母牛胚胎。在牛中,有两种普遍接受的超排卵方法。一种方法包括单次注射马绒毛膜促性腺激素 (eCG),通常在发情周期的第 10 天(其中第 0 天定义为观察奶牛发情的那一天),然后2-3 天后,间隔 12-24 小时注射两次前列腺素 F2α(地诺前列素或氯前列醇)。

目前,一些国家选择的方法是通过连续施用促卵泡激素 (FSH) 来诱导超排卵。心电图治疗诱发的超排卵反应往往大于 FSH 诱发的超排卵反应;然而,在 FSH 处理后,平均会产生更多的可移植(良好)质量的母牛胚胎。出于这个原因,FSH 已成为商业用途的奶牛超排卵的首选方法。

奶牛胚胎移植

两种最常用的商业 FSH 制剂由猪垂体提取物制成,并含有一些黄体生成素 (LH) 污染。虽然 FSH 制剂中的大量 LH 可能会干扰最佳超排卵反应,但据信低水平的 LH 污染不会干扰,甚至可能需要超排卵。使用重组 FSH 的研究发现可移植母牛胚胎的数量没有改善。

尽管单次给药已报告了一些良好的结果,但 FSH 通常连续 4-5 天 IM 给药,每天两次,剂量递减。两种商业 FSH 制剂都可以稀释到 20 mL 的盐水(0.9% NaCl)溶液中,并在 4-5 天内给药。典型的 4 天 FSH 治疗方案如下:第 1 天,每 12 小时 4 mL;第 2 天,每 12 小时 3 毫升;第 3 天,每 12 小时 2 毫升;第 4 天,每 12 小时 1 毫升(总体积 = 20 毫升)。治疗通常在发情后第 10 天开始。在 FSH 治疗的第三或第四天,注射前列腺素 F2α 的黄体溶解剂,并在 12 小时后重复注射。预计 36-48 小时后会发情,人工授精可以根据观察到的发情(发情后 12 和 24 小时)或预约(72、84、

存在几种提高牛超排卵计划效率的方法。例如,在促性腺激素治疗之前诱导新的卵泡波对于增加卵巢对超排卵治疗的反应是可取的。如果在新的卵泡波出现时开始治疗,则对 FSH 治疗的反应会得到改善。诱导新卵泡波的方法示例包括雌二醇注射、GnRH 注射和优势卵泡的经阴道抽吸(卵泡消融)(称为优势卵泡去除 [DFR])。

分别在雌二醇、GnRH 或 DFR 治疗后 4、2 或 1-2 天出现新的卵泡波。当卵泡波出现时开始治疗时,对促性腺激素治疗诱导超排卵的反应最好。这些治疗旨在促进更均匀的卵泡募集和生长,最终可能在每次手术中产生更多可行的胚胎。在美国和许多其他国家,雌激素制剂未被批准用于生殖。

可以在观察自然发情后或基于同步协议对接受者进行管理。在任何一种情况下,在第一次治疗供体奶牛的 PGF2α 前约 12 小时施用溶黄体剂量的 PGF2α。受精母牛与供母母牛在同一天排卵是母牛胚胎移植的首选;然而,±1 天的不同步产生的妊娠率与完全同步的受者相当。预计 75%–90% 将对超排卵治疗有反应;然而,20%–30% 的冲洗奶牛不会产生可移植质量的母牛胚胎。对于成功响应 FSH 治疗的奶牛,在产生优质母牛胚胎方面仍有显着差异的机会(每次冲洗从 0 到 >20)。

母牛胚胎采集在周期的第 7 天完成,届时预计将恢复子宫阶段的胚胎(桑椹胚和胚泡)。在胚胎采集程序之前,对供体母牛进行触诊,并通过触诊每个直肠和超声检查评估卵巢对超排卵治疗的反应,以确定卵巢中黄体的数量。此时,早期发现推定的卵泡囊肿可能有助于在胚胎采集程序后进行激素治疗以解决囊肿状况。

从子宫(冲洗)收集母牛胚胎的程序包括以下步骤:

  1. 给予 5-7 mL 利多卡因的硬膜外麻醉。
  2. 用洗手液或消毒擦洗剂(洗必泰或碘酒)仔细清洗会阴部;根据动物和宫颈的大小,将一根 12F 到 24F 的 Foley 型导管放置在金属棒(管心针)上,将触诊臂置于直肠以通过宫颈进行操作时,将其引入阴道。导管的大小根据身体大小而变化。重要的是在将管心针引入导管之前用无菌水或盐水(0.9% NaCl)溶液润湿管心针,以便在将其放入子宫后从导管中取出。
  3. 一旦进入子宫,导管就被推进到子宫体之外,直到它位于一个子宫角的前三分之一处;然后拔出导管内的管心针,并根据子宫角的大小(随品种、年龄、胎次等而变化)向袖带充气 15–20 mL 的空气。
  4. 然后用市售的、完整的、即用型的冲洗介质冲洗每个子宫角;这些胚胎冲洗液还含有抗菌剂和牛血清白蛋白作为蛋白质来源。一些完全冲洗介质的商业制剂还含有表面活性剂,以尽量减少胚胎搜索盘中泡沫和气泡的形成。过去,必须为每次收集准备冲洗培养基,主要由添加抗菌剂的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 溶液和 1% 胎牛血清 (FBS) 或小牛血清(或 0.1% 牛血清)组成血清白蛋白);在世界各地,许多冲洗仍然以这种方式准备。
  5. 可以通过反复注入少量(25-50 mL)冲洗介质来冲洗子宫角,这些冲洗介质可以排入胚胎过滤器。或者,可以连续冲洗子宫角;通常,1-2 L 冲洗介质用于冲洗母牛子宫。
  6. 冲洗完成后,将袖带放气,小心地让导管的内容物流入位于流出管末端的胚胎过滤器。
  7. 然后将胚胎过滤器带到实验室,并将其内容物分配到带网格的搜索盘中,并在 10 倍放大率的立体镜(解剖显微镜)下检查。

所有牛胚胎都被转移到一个干净的培养皿(带有孔)中,该培养皿含有与冲洗培养基成分相似的保持培养基,除了更高浓度的 FBS 或小牛血清 (10%–20%) 或牛血清白蛋白 (0.4%)。与冲洗介质一样,完整的保持介质也可在市场上买到。然后在更高的放大倍数(40-60 倍)下检查胚胎,并根据其形态、发育阶段(未受精卵母细胞、早期桑椹胚、紧密桑椹胚、囊胚、扩大的囊胚、孵化的囊胚等)和质量(优良、好、公平、差或堕落)。质量评分基于对胚胎物理完整性和形态特征的形态评估,根据胚胎发育阶段、压实状态、细胞质颜色、细胞退化区域、

只有归类为一般、良好或优秀的母牛胚胎才能移植。胚胎在洗涤至少 3 次后保存在培养基中。胚胎洗涤是通过将胚胎转移到不同的、干净的含有保持介质的孔中来进行的。该程序由国际胚胎移植协会推荐,有助于去除粘附在透明带上的细胞碎片和潜在病原体。胚胎在室温下保存在培养基中,直到它们被转移到受体或准备冷冻、二等分(分裂)或胚胎性别鉴定。或者,胚胎可以在转移培养基中冷藏长达 24 小时,而不会明显丧失活力。一些商业胚胎移植团队采用显微手术将胚胎分成相同的两半。移植的胚胎数量可以增加一倍,而妊娠率仅略有下降。然而,冷冻操纵胚胎的技术需要改进。

自 1978 年以来,目前将牛胚胎移植到同步受体中的首选和最常用方法是通过非手术技术。将胚胎装入装有专用(Cassou 型)移液管(即人工授精枪)的小塑料吸管(0.25 mL)中。然后将胚胎移植枪放入由一次性无菌护套保护的阴道中,以防止枪尖被潜在的会阴和阴道污染物污染。枪穿过子宫颈,在每个直肠的触诊辅助下,进入黄体同侧的子宫角。然后小心地将吸管的内容物尽可能地放入子宫角,以避免长时间和不必要的操作。

直接移植单个新鲜母牛胚胎后,预计60%~70%的受体母牛会怀孕;移植两个胚胎可能导致高达 90% 的妊娠率。相当大比例的牛胚胎移植是用冻融胚胎进行的(~46%),如果管理得当,妊娠率通常>50%。在相同的管理条件和训练有素的人员条件下,冻融胚胎的受孕率预计比新鲜牛胚胎移植的受孕率低10%。

虽然移植多个胚胎可能会提高妊娠率,但双胎妊娠相关的难产和胎膜滞留风险以及生产弗里马汀小牛的可能性增加,阻碍了这种方法的广泛使用。在胚胎移植计划中使用性配精液被认为在经济上是可行的,特别是如果注意用与传统未分选精液进行人工授精的精子数量相当的供体奶牛授精的话。