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过滤器是如何过滤牛卵母细胞的?

来源:恒锦莱动物繁殖设备厂家 | 发布时间:2023-09-19 16:18 | 标签:活体采卵过滤器细胞过滤器
回收被血液污染的液体

通过负压泵收集牛卵母细胞的液体中一般会混有血液,因此需要使用卵母细胞过滤器进行过滤。但使用这些过滤器进行过滤清洗时,卵子周围的卵丘细胞可能会脱落,因此需要注意。同时,清洗液可以使用使用添加了1%小牛血清的DPBS,乳酸加磷凝胶液等。
 
(1)卵母细胞过滤器过滤卵泡
 
从采集液中检索卵子首先通过过滤器,这个过滤器筛网是75微米的尼龙筛网,可容纳150ml液体,确保符合要求的卵泡不会通过,但是采集液中含有的血细胞和小细胞会通过,所以放入新的清洗液,含有血液的红色采集液就会变得透明。

过滤器过滤牛卵母细胞操作流程如下所示:

① 将10毫升清洗液(1%CS乳酸林格氏液)加入过滤器中



② 将收集到的液体放入过滤器中


 
③ 用清洗液清洗盛有采样液的离心管,缓慢插入过滤器中(重复两次)
 
④ 缓慢过滤,直至只剩下少量样品:尽量减少过滤步骤。
 
⑤ 沿过滤器壁倒入20毫升清洗液。
 
⑥ 将过滤器的底部和侧面牢固地放在桌子上,以除去过滤器上附着的粘液和血凝块:严禁移液,因为这可能会导致卵丘细胞脱落
 
⑦ 重复步骤(④⑤⑥),直至收集的液体变得澄清。
 
⑧ 当收集的液体变得透明时,将其转移至90-100mm培养皿中。
 
⑨ 检查过滤器(网孔部分)上无粘液或血块,加入20毫升清洗液。
 
⑩ 用移液器慢慢吸出粘液和血块,将其从过滤网片上除去。
 
⑪ 过滤后,加入10ml洗涤液,按⑥除去粘液和血块,转移至⑧培养皿中。
 
⑫ 最后,将 10 ml 洗涤液倒入过滤器中,用移液器吹打去除筛网上残留的颗粒,并将溶液转移至 ⑧ 中的培养皿中。
 
⑬ 如果有大的血凝块,按步骤⑤收集到离心管中,松开(通过移液或用剪刀剪成小块),步骤⑫完成后通过过滤器过滤[视频⑩]
 
⑭ 将收集液转移至90-100 mm培养皿中并收集卵。

下面是细节讲解:

为防止在过滤过程中卵丘细胞损伤,清洗液需要缓慢的沿着过滤器壁注入(看下图),等待液体慢慢排除,重复该操作直到采集液变透明。

沿着过滤器的侧面倒入清洁溶液。

通常3~4次过滤后红血球消失,采集液变透明。



采集液变透明后,将过滤器的侧面及底面接触实验台使其振动,使卵子、夹杂物及粘液等在液体中浮起来,并转移到培养皿中。



此时,检查过滤器上是否有粘液等附着。然后放入约20ml的清洗液,通过向移液管吸引液体,将粘液等从过滤器上剥离,使吸引到移液管的液体通过侧面传递回到过滤器内。反复进行该作业,从过滤器上剥离粘液和血饼,将采集液转移到检索用培养皿中。最后,将10ml的清洗液放入过滤器中,仔细筛选过滤器,将液体转移到检索用培养皿中。



通过过滤器的过滤清洗结束。用显微镜(10~20倍)一个一个地检索培养皿中的卵母细胞,放入了10%小牛血清添加DPBS的35mm培养皿收集卵子。在过滤器内进行吸液的话,卵丘细胞会剥离,所以尽量不要进行吸液。另外,因为采集到的卵子的透明带很柔软,所以和体内受精胚胎一样,如果进行剥离的话,不仅卵丘细胞会脱落,卵子也会损坏,结果采集的卵子会变少。因此,需要如上所述的慎重操作。

(2)使用微型卵母细胞过滤器过滤

也有使用微型卵母细胞过滤器来过滤采样液体的, 将微型卵母细胞过滤器放入 50ml 离心管中,加入样品溶液,然后过滤。 从离心管中取出过滤器,沿管壁缓慢倒入洗涤液,直至收集液或过滤器的网面上没有血液。接下来,将过滤器倒置在 90-100 mm 培养皿上,用注射器将清洗液喷在网片背面,将附着在网片上的卵泡连同异物和粘液一起冲洗下去。最后,检查网片表面是否有异物或粘液。

微型卵母细胞过滤器的使用