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牛的胚胎移植简单介绍

作者:admin | 发布时间:2022-11-18 10:49 | 标签:胚胎移植
虽然偶尔会在牛身上收集单个胚胎,但大多数牛的胚胎移植是在激素处理后进行的,以超排卵供体奶牛,并在收集过程中最大限度地恢复胚胎。在牛中,有两种普遍接受的超排卵方法。一种方法包括单次注射马绒毛膜促性腺激素(eCG),通常在发情周期的第10天(其中第0天定义为在发情期观察到奶牛的那一天),然后在2-3天后注射两次前列腺素F2α(地诺前列素或氯前列醇),间隔12-24小时。

细胞培养箱

目前,一些国家的首选方法是通过连续施用促卵泡激素(FSH)来诱导超排卵。eCG治疗诱导的超排卵反应往往大于FSH诱导的超排卵反应;然而,在FSH处理后,平均会产生更多可转移(良好)质量的胚胎。

两种最常用的商业FSH制剂由猪垂体提取物制成,并含有一些黄体生成素(LH)的污染。虽然FSH制剂中的大量LH可能会干扰最佳的超排卵反应,但据信低水平的LH污染不会干扰,甚至可能需要超排卵。使用重组FSH的研究发现,可移植胚胎的数量没有改善。

尽管单次给药报告了一些良好的结果,但FSH通常在连续4-5天内IM给药,每天两次,剂量递减。两种商业FSH制剂均可稀释到20mL盐水(0.9%NaCl)溶液中,并在4-5天内给药。典型的 4 天 FSH 治疗方案如下:第 1 天,每 12 小时 4 mL;第 2 天,每 12 小时 3 毫升;第 3 天,每 12 小时 2 mL;第 4 天,每 12 小时 1 mL(总体积 = 20 mL)。治疗通常在发情后第 10 天开始。在FSH治疗的第三天或第四天,给予前列腺素F2α的黄体溶解注射并在12小时后重复。预计36-48小时后发情,人工授精可以根据观察到的热量(发情后12和24小时)或通过预约(给予PGF2α后72、84和96小时)安排,同时给予药物以触发排卵(例如,人绒毛膜促性腺激素或促性腺激素释放激素[GnRH])。

存在几种提高牛超排卵计划效率的方法。例如,在促性腺激素治疗前诱导新的卵泡波是可取的,以增加卵巢对超排卵治疗的反应。如果在出现新的卵泡波时开始治疗,则对FSH治疗的反应会得到改善。诱导新卵泡波的方法的例子包括雌二醇注射、GnRH 注射和优势卵泡的经阴道抽吸(卵泡消融)。

存在几种提高牛超排卵计划效率的方法。例如,在促性腺激素治疗前诱导新的卵泡波是可取的,以增加卵巢对超排卵治疗的反应。如果在出现新的卵泡波时开始治疗,则对FSH治疗的反应会得到改善。诱导新卵泡波的方法的例子包括雌二醇注射、GnRH 注射和优势卵泡的经阴道抽吸(卵泡消融)。

接受者的管理可以在观察自然发情后或基于同步协议进行。在任何一种情况下,在供体奶牛的PGF2α首次治疗前~12小时施用黄体溶解剂量的PGF2α。与供体奶牛在同一天排卵的受体奶牛是胚胎移植的首选;然而,±1天的异步产生了与完全同步的接受者相当的怀孕率。预计75%-90%会对超排卵治疗有反应;然而,20%-30%的冲洗奶牛不能产生可移植质量的胚胎。对于成功对FSH处理有反应的奶牛,在产生高质量胚胎方面仍有可能出现显着差异(每次冲洗0至>20)。每个胚胎收集生产5-7个高质量(可转移)的胚胎被认为是足够的商业结果。

胚胎收集在周期的第7天进行,此时子宫阶段的胚胎(桑葚和囊胚)有望恢复。在胚胎收集程序之前,触诊供体奶牛,并通过直肠触诊和超声检查评估卵巢对超排卵治疗的反应,以确定卵巢中黄体的数量。此时,早期发现推定的滤泡囊肿可能有助于在胚胎收集程序后开发激素治疗以解决囊性疾病。

从子宫收集胚胎(冲洗)的过程包括以下步骤:

1、给予含有 5-7 mL 利多卡因的硬膜外mazui。

2、会阴用洗手液或防腐磨砂膏(洗必泰或碘)仔细清洗;根据动物和宫颈的大小,当触诊臂放置在直肠中以通过子宫颈操纵它时,在阴道中引入放置在金属棒上的 12F 至 24F Foley 型导管。导管的大小根据体型而变化。重要的是在将探针引入导管之前,先用无菌水或盐水(0.9% NaCl)溶液润湿探针,以便在将其放入子宫后轻松将其从导管中取出。

3、一旦进入子宫,导管就会超出子宫体,直到它位于其中一个子宫角的前三分之一;然后抽出导管内的探针,并用 15-20 mL 空气给袖带充气,具体取决于子宫角的大小(随品种、年龄、胎次等而变化)。

4、然后用市售的、完整的和即用型冲洗介质冲洗每个子宫角;这些胚胎冲洗溶液还含有抗菌剂和牛血清白蛋白作为蛋白质来源。完全冲洗培养基的一些商业制剂还含有表面活性剂,以尽量减少胚胎搜索培养皿中泡沫和气泡的形成。过去,每次收集都必须准备冲洗培养基,主要由添加抗菌剂的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液和1%胎牛血清(FBS)或牛小牛血清(或0.1%牛血清白蛋白)组成;在世界各地,许多冲洗仍然以这种方式准备。

5、可以通过重复的小容量(25-50 mL)冲洗介质来冲洗子宫角,这些冲洗介质可以排入胚胎过滤器。或者,可以连续冲洗子宫角;通常,1-2 L 冲洗介质用于冲洗奶牛子宫。

6、冲洗完成后,将袖带放气,并小心地让导管的内容物流入位于流出管末端的胚胎过滤器。

7、然后将胚胎过滤器带到实验室,并将其内容物分配到带有网格的搜索盘中,并在立体镜(解剖显微镜)下以10×放大倍率进行检查。

将所有牛胚胎转移到一个干净的培养皿(有孔)中,该培养皿含有与冲洗培养基组成相似的保持培养基,除了更高浓度的FBS或牛小牛血清(10%-20%)或牛血清白蛋白(0.4%)。与冲洗介质一样,完整的保温介质也可在市面上提供。然后在更高的放大倍数(40-60×)下检查胚胎,并根据其形态,发育阶段(未受精卵母细胞,早桑葚,紧密桑葚,囊胚,膨胀囊胚,孵化囊胚等)和质量(优秀,良好,一般,差或退化)进行分类。质量评分基于胚胎发育阶段、压实状态、细胞质颜色、细胞变性面积、挤出卵裂球数量、周晶腔大小以及胚胎大小和球形度对胚胎物理完整性和形态特征的形态学评估。

只有分类为一般、良好或优秀的胚胎才应移植。胚胎在洗涤至少三次后保存在保持培养基中。胚胎洗涤是通过将胚胎转移到含有保持培养基的不同、干净的孔中进行的。该程序由国际胚胎移植协会推荐,有助于去除粘附在透明带上的细胞碎片和潜在病原体。将胚胎保存在室温下保持培养基中,直到它们被转移到受体或准备冷冻、二分(分裂)或胚胎性别鉴定。或者,胚胎可以在转移培养基中冷藏长达24小时,而不会明显失去活力。通过显微手术将胚胎分成相同的两半是由一些商业胚胎移植团队实践的。要移植的胚胎数量可以增加一倍,而怀孕率仅略有下降。然而,冷冻操纵胚胎的技术需要改进。

目前将牛胚胎移植到同步受体中的首选和最常见的方法是通过非手术技术。将胚胎装入胚胎移植枪中,然后将胚胎移植枪放入由一次性无菌盖鞘保护的阴道中,以防止枪尖被潜在的会阴和阴道污染物污染。枪穿过子宫颈,通过直肠触诊的辅助,并推进到与黄体同侧的子宫角。然后将吸管的内容物尽可能颅骨沉积到子宫角中,以避免长时间和不必要的操作。

虽然移植多个胚胎可以增加妊娠率,但与双胎妊娠相关的难产和胎膜保留的风险以及产生游离马丁小牛的可能性增加阻碍了这种方法的广泛使用。在胚胎移植项目中使用有性精液被认为在经济上是可行的,特别是如果注意用精子数量与传统未分选精液进行人工授精的精子数量相当的供体奶牛授精。